Western blot（WB）是一种检测特定蛋白质表达水平的实验技术，跟我们小伙伴的实验生活息息相关，但由于复杂的步骤，一不留神就做不出来，着实让人头疼。小编开了“干湿结合”专栏，“干湿结合”比纯实验周期更短，更容易出阳性结果，加链接，助力大家早日毕业，早日晋升！言归正传，以下是一些确保WB实验顺利进行的建议：

1 样品准备：使用裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）与蛋白酶抑制剂混合，确保样品在4°C下裂解30分钟。

2 蛋白定量：通过BCA法定量蛋白质，确保每个样品的蛋白质浓度在1-2 mg/mL。

3 凝胶电泳：对于小分子蛋白（<50 kDa），使用10%聚丙烯酰胺凝胶；对于大分子蛋白（>50 kDa），使用6%聚丙烯酰胺凝胶，电泳电压设为100V持续1-2小时。

4 转膜：在4°C下，使用100 mA的恒定电流转膜1-2小时。

5 封闭：使用5%脱脂奶粉或3%牛血清白蛋白（BSA）在室温下封闭膜2小时。

6 一抗孵育：使用1:1000至1:5000稀释的一抗，在4°C下孵育过夜（约16-18小时）。

7 二抗孵育：使用1:10000稀释的二抗，在室温下孵育1-2小时。具体稀释倍数根据说明书来定。

8 洗涤：每次抗体孵育后，使用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。

9 曝光条件：使用化学发光底物进行曝光，曝光时间从1秒到5分钟不等，根据实验结果调整。

10 内参控制：选择β-actin或GAPDH作为内参，上样量通常为20-30 μg。

& 实验前，把需要的试剂，耗材，拉个清单出来,比如这样

I.Western blot溶液配制：

A.5× loading buffer

7ml stacking buffer（pH6.8）

5g SDS

1.2mg 溴酚蓝

3ml 甘油

0.1ml 14.4mM belt-巯基乙醇

B.30 %丙烯酰胺液

29 %（w/v） 丙烯酰胺

1 % （w/v） N’N-亚甲基双丙烯酰胺

C.seperating buffer

1.5 M Tris pH 8.8

D.stacking buffer

1.0 M Tris pH 6.8

E.10%AP

1g AP（过硫酸铵）

10ml H2O

F.脱色液

225ml 甲醇

225ml 乙醇

50ml 乙酸

500ml H2O

G.染色液

500ml H2O中加入2.5g考马斯亮蓝R-250，用抽滤的方法去除R-250中的杂质，然后再加入225ml甲醇、225ml乙醇、50ml 乙酸

H.丽春红

丽春红S 2 g

三氯乙酸 30 g

磺基水杨酸 30 g

加ddH2O至100 ml

I.转移缓冲液（10×）

Tris-base 30 g

Glycine 144 g

加ddH2O至1000 ml

转移缓冲液（1×）

100ml 10×转移缓冲液

200ml 甲醇

700ml H2O

J.电泳缓冲液（10×）

Tris-base 30.3 g

Glycine 144 g

SDS 10 g

加ddH2O至1000 ml

K.TBS（10×） pH=7.6

Tris-base 24.2 g

NaCL 80 g

加ddH2O至1000 ml

TBS-T（1×） pH=7.6

100ml TBS（10×） pH=7.6

895ml H2O

5ml 10%tween-20

L.显影液

用250ml的烧杯盛约100mlH2O，微波炉加热至50℃，将小包显影液加入其中溶解，待完全溶解后，加水至1L，然后加入大包显影液，混匀溶解后，分装于棕色瓶中。

M.定影液

一包定影液放入1LH2O中，混匀溶解后，分装于棕色瓶中。

N.striping buffer

2% SDS

100 mM beta-mercaptoethanol

50 mM Tris, pH 6.8