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在进行qPCR实验后,所得到的数据是否可靠,是一个值得关注的问题。如果数据不可靠,就算趋势符合预期,也不应当使用。
如何判断qPCR数据是否可用
第一步:Ct值的评估
Ct值是判断qPCR数据质量的关键指标。以下是Ct值的一般标准:
1、:内参基因的Ct值在14-18之间,目的基因在14-18之间。
2、良好:内参基因的Ct值在12-20之间,目的基因在14-32之间。
3、勉强可用:内参基因的Ct值在10-22之间,目的基因在14-35之间。
如果目的基因的Ct值超过了35,虽然数据仍然可以使用,但可能会对实验结果的准确性产生影响,结果可能偏差很大。因此,如果Ct值偏高,建议重新进行实验。
第二步:溶解曲线的检查
Ct值之后,我们需要仔细检查溶解曲线:
1、熔点(TM):应在75-90°C之间。
2、峰型:应为单峰,无杂峰。
3、峰距:理想情况下,峰距应在5个Tm单位内。
第三步:扩增曲线的观察
虽然扩增曲线可能不是大家经常关注的点,但它同样重要:
1、平台期:曲线应有清晰的平台期。
2、荧光强度(Fluorescence):至少应在3以上。
3、二次抬头:曲线不应出现二次上升。
在大多数情况下,只要前两个依据(Ct值和溶解曲线)没有问题,你们就可以大胆地进入下一步进行数据分析。但为了确保数据的准确性和可靠性,建议在完成qPCR后,也留意一下扩增曲线。
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