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全能型蛋白转印系统选择湿转还是半干转?
2023-10-30 16:34:38 作者: 高思维医疗 1051

Western Blot 是检测混合样品中单一特定蛋白的常用实验技术。实验流程是先采用电泳将蛋白根据分子量大小在凝胶上进行分离,然后再转移到膜上,并用特定的抗体作为探针,对靶蛋白进行检测。其中转膜也称为转印,转印的方法有很多,包括电转印、微量过滤斑点印迹、扩散转印和毛细管转印。

通常电转印、扩散转印和毛细管转印用于电泳分离之后蛋白的转印,而微量过滤斑点印迹直接将均质溶液中的蛋白转到膜上。

扩散转印依赖于分子的热运动,使分子从高浓度区域转移到低浓度区域,转印效率低且大蛋白扩散转印十分困难。毛细管转印使用平板凝胶干燥系统或其他真空装置,将蛋白抽取到膜上,高真空容易粉碎凝胶和膜且凝胶放置时间长易变干,需要大量备用缓冲液。一般扩散转印和真空转印适合于定性实验,而Western Blot实验需要定量,因此电转印更适合于Western Blot实验,也是目前Z常用的转印方法,其转印速度快,转印效率高。

电转印原理:使用电场力驱动蛋白从凝胶中洗脱转移到膜上。此过程中,膜和凝胶放置在一起,并在两个电极之间放置滤纸。在电极之间施加电压,蛋白在电场力的作用下迁移到膜上。原理图如下:


全能型蛋白转印系统选择湿转还是半干转?-2.jpg


电场强度(以V / cm为单位测量)决定转印的效率,理论上场强越高,转印越快;然而电场强度不是可以随意增加的,因为在电转印过程中会产生热量,焦耳热增加了温度并降低了转印缓冲液/三明治的电阻,电阻的这种变化可能导致电场强度和转印的不一致,或者可能导致转印缓冲液失去缓冲能力。因此实际试验中针对不同分子量的蛋白需要进行转印条件优化,以防止转印不足(蛋白不完全从凝胶中转移到膜上)或转印过度(蛋白穿透印迹膜造成损失)。

电转印根据转印设备和流程分为2种主要类型:湿转和半干转。

湿转:将凝胶和膜浸没在装满缓冲液的槽中进行蛋白电转移的过程;可实现大多数常规蛋白的高效、定量转印,且适合各种大小分子量范围的蛋白转印。湿转系统在选择电压设置、转印时间和冷却选项方面具有很大的灵活性。

半干转:凝胶和膜夹在缓冲液润湿的滤纸之间,滤纸与平板电极接触的转印方式;电极之间的距离仅受凝胶和膜夹层厚度的限制决定,这样就实现了高电场强度下的转印。通常半干转比湿转更容易操作,高通量,且转印时间短;同时这种方法可以使用不连续的缓冲体系。但半干转不能使用主动冷却方式进行温度控制,一些小蛋白可能会因高场强而被驱动穿过膜。此外,由于低缓冲容量限制了运行时间,一些大的蛋白可能转印效果不佳。快速半干转属于半干转的一种。

实验操作图(以半干转为例)如下:


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湿转和半干转比较见下图:

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全能型转印系统Trans-Blot Turbo优点如下:

快速转印-预设方案

3 min方案 — 在 3 分钟内完成 Mini-PROTEAN TGX 凝胶的超快速转印(蛋白分子量范围:5–150 kD)

7 min方案 — 在 7 分钟内高效转印 4块个小型或 2 块中型凝胶(蛋白质分子量范围:5–150 kD)

10 min方案 — 在 10 分钟内高效转印 4块小型或 2 块中型凝胶(蛋白质分子量范围:25–300 kD)


全能型蛋白转印系统选择湿转还是半干转?-5.jpg


超高转印效率

与其他印迹技术相比较,使用 Trans-Blot Turb 系统可获得更高的转印效率。下图显示 Trans-Blot Turbo 系统成功转印 1.25 ng 蛋白条带。


全能型蛋白转印系统选择湿转还是半干转?-6.jpg


高通量,模块化设计

高通量:可以同时转印4块小型胶或者2块中型胶。

模块化:转印装配模块与主机独立设计,组合运用。

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