那什么是非特异性扩增呢？且听小编慢慢唠。聚合酶链式反应（PCR）过程中可能而且经常会遇到非特异性扩增的问题，就是PCR扩增后出现的条带与预计的目的基因片段大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。如图所示。

那为什么会出现非特异性扩增呢？首先小友带您先了解一下PCR的原理。聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是在体外模拟生物体内的DNA复制过程，得到大量复制DNA。DNA体内复制依据的是DNA的半保留复制，DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。过程是：双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入特异性引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。因此PCR 反应中的5个主要组分包括：模板（PCR起始原料）、特异性引物（与模板互补的寡聚核苷酸）、dNTPs（单个的脱氧核苷酸(A, C, T, G)）、DNA聚合酶（在延伸过程中加入dNTP）和PCR 缓冲液和辅助因子（提供酶反应的化学反应环境），缺一不可。标准的PCR过程分为三步：变型、退火、延伸。经过30个PCR循环后，1个双链DNA就变成了230个双链DNA。原理图如下：

非特异性条带的出现，究其原因有两个大的方面，原因一：PCR反应成分不合适，包括不限于引物不纯、引物浓度过高、引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体、dNTPs不纯、镁离子浓度过高、DNA聚合酶质量不好或酶含量过高、模板不纯、ddH2O有污染等等，原因二：PCR反应条件不合适，包括不限于退火温度过低、退火时间过长、PCR循环次数过多、延伸时间过长，计算Tm值不正确等等。

改善非特性扩增的程序有很多，今天小友先给大家介绍一种特殊的程序，Touch Down PCR，Touch Down PCR 是对 PCR 的一种改进，是一种通过从高退火温度开始并在 PCR 循环中缓慢降低退火温度直至达到所需退火温度来限制非特异性扩增的技术。Touch Down PCR 来克服非特异性扩增和引物二聚体形成的问题。Touch Down PCR 初始退火温度一般设置为高于计算的引物退火温度 (Tm)5-10℃，再比较高的退火温度下，有利于引物-模板互补性Z高的扩增子的形成且积累；然后在后续循环中逐渐降低，直到达到Z佳退火温度 Tm 。在低退火温度下，理论上容易产生非特性扩增，但因为前期反应中产生了互补性Z高的扩增子（目的条带），形成模板竞争优势来防止非特性扩增，这些目的条带扩增子胜过任何非特异性产物或引物二聚体。

以BioRad T100为例，展示TouchDown PCR程序设置：程序如下，选中退火温度，点击Option选项，在Increment △temp/cycle选项框里输入-0.5℃，点OK，每循环温度变化设置完成，退火温度出现温度计图标表示设置成功。此外，T100还能设置延伸时间不同的TouchDown PCR程序。除了TouchDown PCR之外，还可以设置梯度PCR，改变升降温速率等等，BioRad各型号PCR仪及qPCR仪均支持这些程序的设置。