你了解实验室中蛋白酶抑制剂的作用和原理？

01蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂的作用是什么？

蛋白质纯化、提取过程中常受到其本身存在的水解酶的影响。在提取蛋白质的过程中细胞破碎释放出蛋白酶，这些酶在与欲提取的蛋白质接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质分解。因此，在蛋白质提取过程中，需要加人蛋白酶抑制剂以防止蛋白质水解以保持蛋白质的完整性。

蛋白酶抑制剂的作用原理是什么？

蛋白酶抑制剂（protease inhibitor）从广义上指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。

蛋白酶抑制剂有哪些使用条件？

1. 因为各种蛋白酶对不同蛋白质的性相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。

2. 由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，应注意在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂时应充分混匀，以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

常用的蛋白酶抑制剂有哪些？

1.苯甲基磺酰氟化物( PMSF)

①抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶)，不抑制金属蛋白酶及大部分半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶;

②溶于异丙醇、乙醇、甲醇、1, 2-丙二醇。在水溶液中不稳定，在100%异丙醇内，259℃稳定;

③在室温下可保存一年;

④工作浓度: 0. 1 ~ 1. 0mmol/L;

⑤在水溶液中不稳定，必须在每一次分离和纯化步骤中加人新鲜的PMSF。

2.乙二胺四乙酸钠( EDTA-Na2 )

①抑制金属蛋白水解酶;

②溶于pH 8 ~9的水中，溶液浓度约0.5mol/L; .

③溶液在4℃下可稳定6个月以上;

④工作浓度: 0.2 ~ 1.5mmol/L;

⑤需加入NaOH调节溶液的pH，否则EDTA不溶解。

3.胃蛋白酶抑制剂

①抑制酸性蛋白酶(如胃蛋白酶)、血管紧张肽原酶、组织蛋白酶L和凝乳酶;

②1mg/mL溶于甲醇中，不溶解于水;

③储存液在4℃下一周内稳定，-209℃下可稳定6个月;

④工作浓度：0. 7 ~ 1 μmol/L。

4.亮抑蛋白酶肽

①抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶、血浆酶和组织蛋白酶B;

②10mg/mL溶于水;

③储存液4C下稳定一周，- 20°C下可稳定6个月;

④工作浓度：0. 5mg/mL。

5.胰蛋白酶抑制剂

①抑制丝氨酸蛋白酶( 如血浆酶)、血管舒缓素、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;

②10mg/mL溶于水，pH 7~8，在pH>12.8时失活;

③储存液4°C下稳定一周，-209°C下可稳定6个月，避免反复冻融;

④工作浓度：0. 01 ~ 0.3μmol/L。.

6.抑胃肽

①抑制天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶)、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶和很多微生物的酸性蛋白酶;

②溶于甲醇，约1mg/mL,也可溶于乙醇或6mol/L乙酸(约300ug/mL)，不溶于水，4°C下至少一周内稳定;

③工作浓度: 0. 7μg/mL。

7.胱蛋白酶抑制剂

①抑制半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶B和二肽酰肽酶;

②将500μg胱蛋白酶抑制剂溶解于含20%甘油的重蒸水中，-20°C冷冻，两个月内稳定;

③工作浓度: 250μg/ mL。

02磷酸酶抑制剂

蛋白酶抑制剂的作用是什么？

细胞或组织裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，从而影响后续的蛋白检测。因此在提取物中适量添加外源性磷酸酶抑制剂，有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质和蛋白激酶活性测定等实验过程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维持蛋白质的磷酸化状态。

蛋白酶抑制剂的作用原理是什么？

在细胞信号转导中，靶蛋白会被可将磷酸基团转移到特定位点的蛋白激酶磷酸化。这些磷酸基团在细胞裂解时会被内源性蛋白磷酸酶去除。磷酸酶抑制剂有助于在细胞裂解和蛋白质提取过程中保持磷酸蛋白的活性和状态。

常用的蛋白酶抑制剂有哪些？

常见的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶，常用的磷酸酶抑制剂如下：

1. 氟化钠（sodiμm fluoride）：酸性磷酸酶可逆抑制剂；

2.焦磷酸钠（sodiμm pyrophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆抑制剂；

3.β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆抑制剂；

4.正钒酸钠（sodiμm orthovanadate）：碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制剂：

5.钼酸钠（sodiμm molybdate）：酸性磷酸酶不可逆抑制剂；

6.二水酒石酸钠（sodiμm tartrate dihydrate）：酸性磷酸酶可逆抑制剂；

7. 咪唑（imidazole）：碱性磷酸酶可逆抑制剂。