磷酸化蛋白WB实验注意事项

蛋白磷酸化

细胞信号传导活动是由一系列蛋白传递链构成的，信号传导的过程中涉及到多种蛋白质可逆磷酸化过程。蛋白质通过可逆磷酸化，以及不同的级联反应将信号放大传递。蛋白磷酸化是蛋白激酶在靶蛋白的氨基酸残基上添加磷酸基团的一种可逆的翻译后修饰。蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素介导的蛋白降解等过程。

Western Blot 是检测磷酸化蛋白质的重要实验方法，然而磷酸化蛋白可能仅占细胞总蛋白中的一小部分，处理不得当时还会快速的去磷酸化。磷酸化蛋白质 WB 做不好的原因有许多，比如封闭问题、抗体问题、或所需的磷酸化蛋白可能不存在于样品中或者低于 WB 检测量。总结了以下操作事项，供大家在做磷酸化蛋白的时候参考，希望对实验中有所帮助。

1.确定样本中磷酸化蛋白的表达量

正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，需要通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，不同蛋白刺激条件各不相同，刺激的时间和强度需要根据文献和预实验来确定，可以利用PhosphoSitePlus数据库（https://www.phosphosite.org）查询蛋白的磷酸化情况。

2.冰上操作

样本一旦开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。在做磷酸化蛋白的整个实验过程中都要保证低温环境，始终将样品置于冰上或维持在 4 °C，并在一开始就向裂解缓冲液中新鲜加入合适的抑制剂，能够显著减缓上述反应。

3.使用磷酸酶抑制剂

由于蛋白的磷酸化是可逆的，组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异。因此，在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，对于维护蛋白质的磷酸化状态非常重要，否则可能导致条带很浅或者没有条带。此外，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以另一个关键是要尽量使用无菌清洁的试剂和凝胶。

4.优化封闭条件

一般的WB实验中，我们通常使用 5 % 脱脂牛奶的TBST或着 5 % BSA 的TBST 室温封闭1 h。但值得注意的是，脱脂牛奶是许多种蛋白质的混合物，其中含有酪蛋白，是一种磷蛋白。如果我们的目标蛋白为磷酸化蛋白的话，救千万不要选择脱脂奶粉，否则会有很多背景信号。另外应避免膜封闭时间过长，防止掩盖抗原表位，阻止抗体结合。

5.检测总蛋白含量

在检测磷酸化蛋白同时，往往也需要检测总蛋白。仅仅检测到磷酸化蛋白表达量的升高或降低并不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值增加或减少了才能说明磷酸化水平的变化。绝大部分情况下磷酸化和总蛋白的条带位置基本是一样的，我们常规的做法是在做完磷酸化抗体后，将膜 Strip 后再孵育总蛋白抗体。

但是在实际的实验过程中，让⼈担⼼影响实验结果的就是stripping/Reprobing 环节了。要闭着眼睛剥离抗体，谁也不确定磷酸化⼀抗有没有剥离⼲净；也不知道会不会把⽬标蛋⽩也⼀起洗掉了。那么这种情况下，多⾊荧光就是磷酸化WB实验很好⼀个选择了。通常会使⽤⼀种荧光标记的抗体杂交磷酸化蛋⽩；同时，使⽤另外⼀种荧光标记的抗体杂交总蛋⽩（磷酸化和⾮磷酸化），然后通过不同荧光信号通道对磷酸化及总蛋⽩进⾏区分。这样就可以避免抗体剥离/重杂交的步骤，也避免了对实验结果的影响。

Bio-Rad公司的全能成像系统ChemiDoc MP，搭载了天文照相级的CCD，配置五色荧光通道（RGB+2IR）,可兼容市场上常见的荧光染料，每个通道单独激发和检测，避免荧光串扰。系统内部具有低荧光背景涂层，可以进一步排除背景干扰。可轻松助力您的磷酸化研究。 

6. 4℃过夜孵育一抗

4℃抗体孵育条件非常重要。因为抗原抗体之间是一种非共价的结合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗体，这种物理吸附在高温下会变弱，容易脱落。其次要保证抗原和抗体相互磨合孵育的时间，磷酸化蛋白只占总量的极少部分，过夜可保证充分结合进而曝出更漂亮的条带。重要的之一，抗体质量一定要好！！！